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Punto sui nuovi farmaci per la fibrosi cistica 2014

Punto  sui nuovi farmaci  per la fibrosi cistica  2014A.O.U. A. Meyer Aula Magna (1° piano) 25 Ottobre 2014 - Il Meeting è aperto alla partecipazione delle persone assistite dal Centro ed ai loro familiari. Per i noti criteri di prevenzione delle infezioni, tutti coloro che sono portatori di Burkholderia cepacia o sono stati sottoposti a trapianto o avessero sintomi compatibili con una malattia acuta virale, come influenza o raffreddore, sono invitati a non partecipare.

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Il Laboratorio del Centro Regionale Toscano di riferimento per la Fibrosi Cistica

 

Il coordinatore del Laboratorio è la Dr.ssa Silvia Campana. Per l’organigramma e funzionigramma del Laboratorio si veda un’altra sezione del sito web (“Organigramma e staff”).

- Telefono: 055 5662509 (Fax: 055 5662474)
- E-mail: Questo indirizzo e-mail è protetto dallo spam bot. Abilita Javascript per vederlo.


Lo staff del Laboratorio del Centro Regionale di Fibrosi Cistica

Il personale del Laboratorio.
Da sinistra: la Dr.ssa Silvia Campana, la Dr.ssa Daniela Dolce, la Dr.ssa Novella Ravenni, la Dr.ssa Priscilla Cocchi e Gianfranco Mergni.

- Il laboratorio del Centro Regionale Toscano di riferimento per la Fibrosi Cistica dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria Meyer esegue tutti gli esami diagnostici e di follow-up per i pazienti affetti da fibrosi cistica della regione Toscana e di altre regioni.
Considerate le caratteristiche cliniche della fibrosi cistica, nessuna prestazione è eseguita in regime di urgenza, a parte il test del sudore in alcune situazioni cliniche.

- Per alcune attività (esami di funzionalità del pancreas esocrino, esami microbiologici specifici colturali e molecolari, esami epidemiologici per infezioni da batteri opportunisti) il laboratorio è il punto di riferimento anche di altre strutture della
Regione Toscana.
Tali esami sono spesso richiesti per la diagnosi e il monitoraggio di patologie diverse dalla fibrosi cistica come ad es. patologie polmonari, infezioni da opportunisti in pazienti immunocompromessi, affezioni gastroenteriche.

- Per alcune attività altamente specialistiche (identificazione e tipizzazione molecolare di particolari batteri opportunisti, indispensabili ai fini epidemiologici e per i pazienti fibrocistici candidati a trapianto bipolmonare, il laboratorio è Centro Nazionale di Riferimento riconosciuto dalla Società Italiana di Fibrosi Cistica e pertanto riceve campioni provenienti da tutto il territorio italiano.

- Alcune indagini, come la ricerca ed identificazione di Micobatteri, sono eseguite presso il Laboratorio di Microbiologia e Virologia dell’Azienda Ospedaliero-Univeristaria Careggi, perché Centro di riferimento Regionale per la diagnostica dei Micobatteri.
Anche le indagini di genetica umana sono eseguite presso l’UO di Citogenetica dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria di Careggi, che è Centro di Riferimento Regionale per tali indagini di prevenzione e diagnosi della fibrosi cistica.


Le linee diagnostiche del Laboratorio sono le seguenti:

a) Screening neonatale della Fibrosi Cistica
Tale screening è effettuato in Toscana esclusivamente da questo laboratorio, che è di riferimento regionale, su circa 35.000 neonati all’anno provenienti da 30 punti nascita della Regione Toscana.
Il Laboratorio vanta un’esperienza di oltre 25 anni nello screening neonatale per la fibrosi cistica.
Lo screening prevede un preciso iter diagnostico: determinazione della tripsina immunoreattiva (IRT) (Autodelphia, Perkin Elmer) su goccia di sangue prelevata in 1-2° giornata e della lattasi su meconio, prelevato alla nascita. Nel caso di un valore di IRT sopra la soglia, il prelievo e la determinazione di IRT si ripete a circa 1 mese di vita. Il test conclusivo è il test del sudore, con determinazione quantitativa del cloro sudorale. Il processo diagnostico dello screening neonatale è impostato tenendo conto delle linee guida internazionali (Castellani C, J Cyst Fibros 2009; 8:153-73 - Wilcken B et al. Paediatr Respir Rev 2003; 4:272-7 - Southern KW et al. J Cyst Fibros 2007; 6:57-65).
Dal 1 Gennaio 2010 il laboratorio effettua lo screening anche su tutti i neonati (circa 8000/anno), provenienti da 9 punti nascita della Regione Umbria. Dal 2010 il programma di screening neonatale per la fibrosi cistica includerà anche l’indagine genetica nei neonati con IRT elevato in 1-2° giornata.

b) Monitoraggio della funzione del pancreas esocrino
Tali indagini per il monitoraggio sono indispensabili per la diagnosi ed il monitoraggio di alterazioni di attività nella funzionalità del pancreas esocrino non solo per i pazienti affetti da fibrosi cistica ma anche per molte altre patologie gastroenteriche: al laboratorio afferiscono prelievi provenienti da tutta l’azienda e anche da altre strutture della Regione Toscana.
In particolare si eseguono i seguenti tests:

- Steatocrito: tale test, eseguito con metodica manuale, evidenzia lapercentuale di grassi presenti a livello fecale.

- Chimotripsina fecale: è un test che valuta con una reazione di cinetica enzimatica, la quantità di chimotripsina (enzima pancreatico) presente nelle feci.

- Elastasi fecale 1: tale test prevede il dosaggio di un enzima pancreatico con metodica ELISA; a differenza della chimotripsina fecale il suo valore non è influenzato dalla eventuale somministrazione di terapia enzimatica sostitutiva; è un test più sensibile e specifico della chimotripsina e nel corso dell’anno soppianterà l’uso della chimotripsina.

c) Esami batteriologici per patogeni polmonari

Esami colturali

L’attività del laboratorio di microbiologia del centro regionale di Firenze è nata e si è sviluppata per lo studio delle infezioni polmonari dovute a patogeni opportunisti.
Tali infezioni, sebbene possano presentarsi in tutti gli ambiti nosocomiali, interessano in particolar modo reparti a rischio come terapia intensiva, pazienti immunocompromessi o affetti da altre patologie quali fibrosi cistica, sindrome di Kartagener, granulomatosi cronica.
Le infezioni dovute a tali patogeni opportunisti possono avere carattere epidemico ed essere responsabili di infezioni broncopolmonari anche gravi.
Molti di questi batteri non sono individuati con le tecniche colturali classiche e per alcuni c’è necessità di terreni di coltura specifici come il Burkholderia cepacia selective Agar. Per la corretta identificazione i normali test biochimici sono spesso insufficienti, ed è necessario utilizzare tecniche molecolari specifiche.
Anche per i test di chemiosensibilità i metodi automatizzati utilizzati in genere per questo tipo di test non sono affidabili, poichè i patogeni sono caratterizzati da una crescita particolarmente lenta, quindi sono indicate tecniche manuali non proponibili nei grandi laboratori di diagnostica microbiologica. Test specifici di chemiosensibilità sono inoltre effettuati sui batteri opportunisti multiresistenti (la cui incidenza è in crescita in tutti gli ambiti nosocomiali), valutando l’eventuale effetto sinergico dell’associazione di farmaci. Anche tale test non è effettuato nei laboratori di diagnostica microbiologica.
Per tutti questi motivi le linee guida internazionali (Cystic Fibrosis Trust Infection Control Group. A statement on Burkholderia cepacia, 1999 – Saiman L et al.
Infection control recommendations for patients with cystic fibrosis: microbiology, important pathogens, and infection control practices to prevent patient-to-patient transmission.
Infect Control Hosp Epidemiol 2003: 24: (5 Suppl)S6-S52 and Am J Infect Control 2003; 31:(3Supppl) S1-S62) ritengono indispensabile che gli esami batteriologici relativi a pazienti con fibrosi cistica vengano effettuate presso strutture altamente specializzate e la microbiologia della fibrosi cistica è ormai da tutti riconosciuta come una sub-specialità a parte.

Identificazione batterica
Il Laboratorio esegue l’identificazione batterica con tecniche biochimiche manuali (l’uso dei sistemi automatizzati normalmente utilizzati nella routine diagnostica non sono indicati per questo tipo di patogeni, vedi linee guida internazionali già citate).

- Per alcune specie, che non si identificano con i test biochimici classici, si effettua una identificazione con tecniche molecolari basate sull’amplificazione di frammenti genici specifici (P. aeruginosa, B. cepacia) ed eventuale successiva analisi di restrizione.
Per quanto riguarda l'identificazione di B. cepacia complex è necessario eseguire, oltre all'amplificazione, anche il sequenziamento di specifici frammenti genici.

- I test molecolari di identificazione rapida possono essere effettuati direttamente su campione biologico fornendo risultati diagnostici altamente sensibili e specifici in tempi ridotti (1-2 giorni) rispetto alle indagini diagnostiche di routine (5-7 giorni).
Tale approccio molecolare, che si avvale di metodi diversi applicati in sequenza, è attualmente l’unico in grado di identificare con certezza i microrganismi di un importante patogeno opportunista in fibrosi cistica e nelle immunodeficienze: B. cepacia complex (un complesso di 15 specie diverse con diversa trasmissibilità ed impatto clinico).

- Per tutti i microrganismi di difficile identificazione si effettua amplificazione del gene via PCR che codifica per l’rRNA 16S e successivo sequenziamento. Le sequenze così ottenute e confrontate on-line con quelle contenute nel database (NCBI), permettono di identificare genere e specie del batterio sconosciuto.

- Per batteri che presentano difficoltĂ  colturali (in particolare gli opportunisti del gruppo dei gram- non fermentanti) viene effettuato un test molecolare con ricerca del DNA direttamente su campione biologico (ad esempio amplificazione direttamente dal
campione respiratorio di un frammento di DNA specifico per P. aeruginosa).
Tale approccio permette di effettuare tali indagini anche su campioni biologici di scarsa entitĂ  quali si ritrovano frequentemente in pazienti pediatrici.
Questi esami indispensabili per la diagnosi ed il monitoraggio delle infezioni da batteri opportunisti difficili sia nei pazienti con fibrosi Cistica che in altre patologie, sono inoltre indispensabili per poter inserire i pazienti con fibrosi cistica nelle liste per il trapianto polmonare.

- Per l’identificazione di batteri difficili il Laboratorio del Centro Fibrosi Cistica è Centro di Riferimento Nazionale (riconosciuto dalla Società Italiana di Fibrosi Cistica) e riceve quindi campioni da tutto il territorio Italiano.


Caratterizzazione di particolari fattori di virulenza
Per alcuni patogeni è di fondamentale importanza valutare la presenza di fattori genetici che sono legati ad una particolare patogenicità.

- Per quanto riguarda B. cepacia complex si evidenzia con uno specifico test molecolare mediato da amplificazione un frammento genico detto “isola di patogenicità” che si ritrova nei ceppi responsabili di epidemie gravi.

- Per quanto riguarda invece i patogeni che appartengono al gruppo dei Gram positivi, vengono caratterizzati, tramite un test di amplificazione specifica con PCR, i ceppi di Stafilococco aureo meticillino-resistenti, che recentemente sono causa emergente di importanti epidemie ospedaliere e che sono denominati ceppi associati a comunitĂ  (CA-MRSA).
Tali ceppi sono in grado di produrre una potente tossina (Panton Valentin leucocidina) responsabile della loro patogenicitĂ .
La produzione di tale tossina viene testata tramite amplificazione via PCR del frammento genico che la codifica.
Tramite specifici test di amplificazione è inoltre testata la produzione di tossine esfoliative da parte dei ceppi S. aureus.
La produzione di tali tossine è collegata a importanti quadri clinici.
La valutazione della produzione di specifiche tossine è di fondamentale importanza per la caratterizzazione dei ceppi altamente patogeni S. aureus e di MRSA in tutti gli ambiti ospedalieri.

Indagini immunologiche
Per il monitoraggio e la scelta terapeutica di alcune infezioni polmonari quali quelle dovute a P. aeruginosa è di fondamentale importanza il monitoraggio della risposta immunitaria dell’ospite.
A tal fine si eseguono indagini sierologiche per la determinazione della presenza di anticorpi specifici (IgA e IgG) anti-P.aeruginosa con test ELISA.
Il laboratorio del Centro è l’unico che esegue queste indagini nella Regione Toscana.

Indagini epidemiologiche
I patogeni opportunisti sono in grado di provocare epidemie con trasmissione degli stessi ceppi da pazienti o da fonti ambientali sia in FC sia in altre situazioni patologiche. Per la prevenzione ed il precoce trattamento dei focolai epidemici sono necessarie specifiche indagini molecolari che sono in grado di identificare all’interno della stessa specie cloni che abbiano particolare caratteristiche di virulenza e trasmissibilità.
Presso il laboratorio del centro si raccolgono e conservano da oltre 10 anni ceppi batterici isolati da pazienti affetti da Fibrosi Cistica e da altre patologie predisponenti a infezioni da opportunisti, provenienti sia dal complesso Meyer sia da tutto il territorio Italiano (per un totale di circa 3000 isolati clinici ed ambientali).
A fini epidemiologici il laboratorio del centro esegue la tipizzazione genetica di ceppi potenzialmente epidemici quali. P. aeruginosa, B. cepacia complex, S.aureus meticillino-resistente di isolamento clinico ed ambientale, con tecniche molecolari ritenute il gold standard, quali elettroforesi a campo pulsato (PFGE) e Random Amplified Polimorphyc DNA (RAPD). Il profilo genetico dei ceppi analizzati è acquisito ed archiviato con un apposito software.
In questo modo è stata costruita una “banca epidemiologica” dei ceppi batterici che può essere utilizzata per confrontare ogni nuovo ceppo con quelli già analizzati ed aquisiti, chiarendo le possibili vie di trasmissione e le possibili fonti ospedaliere di infezione, e consententendo quindi di migliorare la prevenzione ed il controllo delle infezioni ospedaliere.
I ceppi clinici potenzialmenti epidemici sono rappresentativi della flora batterica isolata in alcuni reparti di degenza dell’Azienda Meyer e da tutti i pazienti FC in followup nel Centro Regionale.
Il laboratorio è da considerare il punto di riferimento per lo studio dell’epidemiologia da germi patogeni negli altri centri regionali per la fibrosi cistica.
Tale attività, altamente specialistica, di controllo delle epidemie ha portato più volte a segnalare ai responsabili di altri reparti dell’Azienda Meyer e strutture ospedaliere, finalizzate alla cura della FC in Italia, infezioni crociate intraospedaliere.
Significativi riconoscimenti internazionali sono stati dati al Laboratorio per questa attivitĂ .




Testo a cura di
Laboratorio del Centro Regionale Toscano di Riferimento per la Fibrosi Cistica

Ultima revisione
Gennaio 2010

 

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