16 gennaio 2017

Il Laboratorio

Il Laboratorio del Centro Regionale Toscano di Riferimento per la Fibrosi Cistica

Il laboratorio del Centro Regionale Toscano di riferimento per la Fibrosi Cistica esegue tutti gli
esami diagnostici e di follow-up per i pazienti affetti da fibrosi cistica della regione Toscana e di
altre regioni. Considerate le caratteristiche cliniche della fibrosi cistica, nessuna prestazione è
eseguita in regime di urgenza, a parte il test del sudore in alcune situazioni cliniche (richiamo per
positività dello screening neonatale).
Per alcune attività (esami di funzionalità del pancreas esocrino, esami microbiologici specifici
colturali e molecolari, esami epidemiologici per infezioni da batteri opportunisti) il laboratorio è il
punto di riferimento anche di altre strutture della Regione Toscana e non solo. Tali esami sono
spesso richiesti per la diagnosi e il monitoraggio di patologie diverse dalla fibrosi cistica come ad
es. patologie polmonari, infezioni da opportunisti in pazienti immunocompromessi, affezioni
gastroenteriche.

Per alcune attività altamente specialistiche (identificazione e tipizzazione molecolare di particolari
batteri opportunisti, indispensabili ai fini epidemiologici e per i pazienti fibrocistici candidati a
trapianto bipolmonare), il laboratorio è Centro Nazionale di Riferimento riconosciuto dalla Società
Italiana di Fibrosi Cistica e pertanto riceve campioni provenienti da tutto il territorio italiano.
Alcune indagini, come la ricerca ed identificazione di Micobatteri, sono eseguite presso il
Laboratorio di Microbiologia e Virologia dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi, perché
Centro di riferimento Regionale per la diagnostica dei Micobatteri. Anche le indagini di genetica
umana, applicate al programma di screening neonatale, sono eseguite presso l’UO di Citogenetica
dell’Azienda Ospedaliero-Universitaria di Careggi, che è Centro di Riferimento Regionale per tali
indagini di prevenzione e diagnosi della fibrosi cistica.

Linee diagnostiche del Laboratorio

a) Screening Neonatale per la Fibrosi Cistica

Attualmente il laboratorio del Centro FC esegue lo screening neonatale per tutta la Toscana (27 punti nascita), tutta l’Umbria (8 punti nascita) ed il Presidio di San Giovanni Rotondo in Puglia, per un totale di circa 40.000 neonati all’anno.

Il Laboratorio vanta un’esperienza di oltre 35 anni nello screening neonatale per la fibrosi cistica.
L’iter diagnostico ha inizio con la determinazione della tripsina immunoreattiva (IRT) con metodica
immunofluorescente (apparecchiatura GSP della Perkin Elmer) su goccia di sangue prelevata in 2°-
3° giornata ed essiccata su carta bibula. Su tutti i campioni superiori ad una certa soglia (fissata al
99° centile) viene poi eseguita la determinazione della lattasi su meconio, strisciato al momento
della nascita su carta bibula.
In dipendenza dei risultati ottenuti di IRT e lattasi meconiale il processo diagnostico può
considerarsi concluso o richiedere una seconda verifica di IRT a circa un mese di età o richiedere la
verifica conclusiva con il test del sudore. Questo test rappresenta il test conclusivo del processo di
screening neonatale, che consente di fare diagnosi di malattia.
Il processo diagnostico dello screening neonatale è impostato tenendo conto delle linee guida internazionali (J Cyst Fibros 2009; 8:153-73 – Paediatr Respir Rev 2003; 4:272-7 – J Cyst Fibros
2007; 6:57-65).
Al protocollo citato dal 2010 è stato affiancato, per la sola Toscana, il protocollo IRT/DNA: sullo
spot di sangue di tutti i bimbi con IRT superiore al 99° centile vengono ricercate le mutazioni a
maggior frequenza sul gene che causa FC (attualmente vengono ricercate 59 mutazioni ed 8
delezioni); tutti coloro che risulteranno avere anche 1 sola mutazione/delezione saranno poi
richiamati ad effettuare il Test del Sudore.

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b) Test del Sudore

Il Test del Sudore rappresenta il test diagnostico per la Fibrosi Cistica: si applica ad ogni sospetto di diagnosi, ed è punto finale di qualsiasi protocollo di screening neonatale per fibrosi cistica. Il test viene effettuato dal nostro Centro secondo la metodica quantitativa di Gibson e Cooke, metodica che rappresenta il “gold standard” per diagnosi di fibrosi cistica.

Per la sua esecuzione facciamo riferimento alle “Raccomandazioni Italiane”, basate sulle Linee
guida internazionali. Il test si divide essenzialmente in due fasi: una fase di stimolazione, affidata al
personale infermieristico dell’Ambulatorio FC ed una fase analitica di cui invece è responsabile il
tecnico di laboratorio e/o il biologo, che eseguono il dosaggio. I risultati del test del sudore sono
visionati e controfirmati anche dai medici dell’Ambulatorio FC.

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c) Monitoraggio della funzione del pancreas esocrino

Le indagini che il Laboratorio del Centro FC attua per il monitoraggio della funzionalità pancreatica sono due:

− Steatocrito: misura la percentuale di grassi presenti a livello fecale, dopo aver raccolto un
singolo campione di feci o un pool di feci di giorni diversi.
− Elastasi fecale: questo enzima è prodotto dal pancreas ed indica che l’organo produce una
sufficiente quantità di enzimi per la digestione del cibo. La sua attività è indipendente dalla
contemporanea somministrazione di enzimi pancreatici. L’elastasi è dosata su un singolo
campione di feci con metodica ELISA colorimetrica.

Tali indagini sono indispensabili per la diagnosi e il monitoraggio dell’attività del pancreas per
pazienti affetti da fibrosi cistica o da altre patologie gastroenteriche. Al Laboratorio afferiscono
infatti campioni provenienti dall’AOU Meyer e da altre strutture della Regione Toscana.

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d) Esami microbiologici di I e II livello

L’attività del Laboratorio è nata e si è sviluppata per lo studio dei patogeni opportunisti che causano infezioni polmonari tipiche dei pazienti affetti da Fibrosi Cistica.

Le linee guida nazionali e internazionali (www.sifc.it – Infect Control Hosp Epidemiol 2014; 35:S1-
S67) ritengono indispensabile che gli esami batteriologici della Fibrosi Cistica vengano effettuati
presso strutture altamente specializzate, in quanto tale specialità è riconosciuta come una ristretta
nicchia all’interno del vasto panorama della microbiologia diagnostica. A causa del particolare
microambiente costituito dal polmone di tali pazienti e della pressione selettiva esercitata dalle
terapie antibiotiche, i batteri reagiscono mettendo in atto una serie di meccanismi di adattamento
che rendono più difficile il loro isolamento, l’identificazione e l’esecuzione dei test di sensibilità. La
varietà, la ricchezza, e la rapidità di tali meccanismi è sconcertante: per ricordarne solo alcuni, i batteri hanno un altissimo tasso di mutazioni genetiche (ceppi ipermutabili) che permettono loro di
aumentare la possibilità di adattamento, di essere meno sensibili all’azione di alcuni farmaci, e di
trasformare anomalie metaboliche (auxotrofismo) in un vantaggio selettivo. In questo ambiente di
crescita, le cellule batteriche possono organizzarsi tra loro in particolari architetture (biofilm),
producendo una matrice esterna che li protegge dalle difese dell’ospite e dall’azione degli
antibiotici. Appare quindi chiaro che cimentarsi con questa particolare branca della microbiologia
diagnostica rappresenta una sfida per il microbiologo: infatti gli approcci tecnici devono essere
specifici e in continuo aggiornamento. Anche se peculiare, questa nicchia della microbiologia può
rappresentare, per molti aspetti, un modello; ad esempio la selezione e l’evoluzione di
microrganismi multiresistenti ai farmaci, quali Pseudomonas aeruginosa, può aiutare nella
comprensione dei meccanismi genetici di adattamento tipici di alcuni batteri Gram-negativi non
fermentanti.

Isolamento ed identificazione batterica
Rispetto alla microbiologia tradizionale, i terreni di coltura usati per l’isolamento batterico sono in
numero maggiore, in quanto alcuni microrganismi hanno esigenze di crescita particolari: per
esempio, per l’isolamento dei batteri appartenenti al Burkholderia cepacia complex, sussiste la
necessità di utilizzare terreni di coltura specifici come il Burkholderia cepacia selective agar.
Per l’identificazione batterica, i normali test biochimici sono spesso insufficienti, ed è necessario
utilizzare tecniche specifiche come la spettrometria di massa o dei test di biologia molecolare. Il
Laboratorio del Centro si avvale di tecniche di spettrometria di massa tipo MALDI-TOF MS
(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight Mass Spectrometry), attualmente uno
degli approcci più avanzati e sofisticati per un’identificazione rapida, nell’ordine di minuti,
altamente specifica e affidabile. Per alcuni microrganismi è necessario ricorrere a metodiche di
biologia molecolare, quale l’amplificazione del gene che codifica per l’rRNA 16S e successivo
sequenziamento. Le sequenze così ottenute, confrontate con quelle di database on-line
internazionali, permettono di identificare genere e specie del batterio sconosciuto. In particolare, per
quanto riguarda i batteri appartenenti al Burkholderia cepacia complex, è necessario eseguire
l’amplificazione e il sequenziamento di specifici frammenti genici (recA). Tale approccio è
attualmente l’unico in grado di identificare con certezza i microrganismi di questo gruppo, un
complesso che comprende 17 specie diverse con differente trasmissibilità ed impatto clinico. Il
Laboratorio di Firenze è il Centro di Riferimento della Società Italiana Fibrosi Cistica per
identificazione dei batteri appartenenti al Burkholderia cepacia complex: tale identificazione è
richiesta dai centri di trapianto polmonare come condizione indispensabile per iscrivere i pazienti
alle liste di attesa, e come tale il Laboratorio di Firenze riceve da tutti i centri italiani isolati batterici
da identificare.

Test di chemiosensibilità
Per l’esecuzione dei test di chemiosensibilità, i metodi automatizzati di cui si avvalgono i laboratori
di diagnostica microbiologica non sono affidabili poichè questi patogeni sono caratterizzati da una
crescita particolarmente lenta o da particolari fenotipi delle colonie. Per l’esecuzione degli
antibiogrammi di ceppi batterici isolati da pazienti con Fibrosi Cistica, sono quindi indicate tecniche
completamente manuali o semiautomatizzate, non gestibili nei grandi laboratori di diagnostica
microbiologica.
Test specifici di associazione di farmaci sono inoltre effettuati sui batteri opportunisti multiresistenti
o panresistenti, valutando l’eventuale effetto sinergico o antagonista dell’associazione di antibiotici.
Attualmente il Laboratorio è uno dei laboratori in grado di eseguire tali test.

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e) Indagini immunologiche

Per il monitoraggio delle terapie antibiotiche delle infezioni polmonari dovute a Pseudomonas aeruginosa, è di fondamentale importanza la valutazione della risposta immunitaria dell’ospite. A tal fine si eseguono indagini sierologiche per la determinazione di specifiche IgG anti-Pseudomonas aeruginosa con test ELISA. Il laboratorio del Centro di Firenze è l’unico che esegue questa tipologia di analisi in tutta la Regione Toscana.

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f) Indagini epidemiologiche

Sia in Fibrosi Cistica che in altre realtà a rischio per le infezioni ospedaliere, i batteri opportunisti sono in grado di provocare epidemie, con trasmissione da paziente a paziente o contaminazione da fonti ambientali.

A fini epidemiologici il Laboratorio del Centro di Firenze esegue la tipizzazione genetica di ceppi
batterici potenzialmente epidemici, di isolamento clinico od ambientale, quali: Pseudomonas
aeruginosa, Burkholderia cepacia complex, Staphylococcus aureus meticillino-resistente,
Enterobatteriaceae con particolari meccanismi di resistenza.
Il profilo genetico dei ceppi viene eseguito con varie tecniche molecolari, quali Pulsed-Field Gel
Electrophoresis (PFGE), Repetitive extragenic palindromic PCR (Rep-PCR) e Multi locus
Sequence Typing (MLST) e successivamente analizzato con un apposito software. In questo modo è
possibile costruire una “banca epidemiologica” di ceppi batterici che può essere utilizzata per
confrontare ogni nuovo ceppo con quelli già analizzati ed acquisiti: questo procedimento permette
di chiarire le possibili vie di trasmissione batterica e le possibili fonti ospedaliere e ambientali di
contagio. Tali specifiche indagini molecolari, che sono in grado di identificare all’interno della
stessa specie cloni con particolare caratteristiche di virulenza e trasmissibilità, consentono di
migliorare la prevenzione ed il controllo delle infezioni nosocomiali ed il trattamento precoce di
eventuali focolai epidemici.
Il Laboratorio è da considerare un punto di riferimento per gli studi epidemiologici di batteri
patogeni che riguardano i pazienti affetti da Fibrosi Cistica afferenti sia al Centro di Firenze che ad
altri centri italiani. A tal proposito, il Laboratorio partecipa attivamente a progetti di ricerca
epidemiologici nazionali e internazionali con significativi riconoscimenti.
Presso il Laboratorio si raccolgono e conservano inoltre da più di 20 anni ceppi batterici isolati da
pazienti affetti da Fibrosi Cistica, ma anche da pazienti affetti da altre patologie predisponenti a
infezioni da opportunisti, provenienti sia dall’AOU Meyer che da Aziende Ospedaliere di tutto il
territorio italiano.

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g) Altri campi di attività del Laboratorio

Per alcuni batteri patogeni è di fondamentale importanza valutare la presenza di fattori genetici che sono legati ad una particolare patogenicità, virulenza e resistenza antibiotica.

Per quanto riguarda i microrganismi che appartengono al gruppo dei batteri Gram-positivi, vengono
caratterizzati, tramite un test di amplificazione specifica, i ceppi di Staphylococcus aureus
Meticillino-Resistenti (Meticillin-Resistant Staphylococcus aureus, MRSA), causa emergente di
importanti epidemie ospedaliere. In base alla caratterizzazione molecolare della loro
“Staphylococcal Cassette Chromosome mec” (SCCmec), un elemento genetico mobile integrato nel
cromosoma di MRSA, possiamo distinguere tra ceppi associati a comunità (Community-Acquired
o CA-MRSA) e ceppi di acquisizione ospedaliera (Hospital-Acquired o HA-MRSA). Sono stati identificati diversi tipi di SCCmec (da I a VIII). I CA-MRSA sono in genere più virulenti degli HAMRSA
a causa della produzione di molti fattori di virulenza collegati a importanti quadri clinici.
Una delle tossine più potenti è la Leucocidina di Panton Valentine (PVL), fattore di virulenza
associato a varie manifestazioni, come la polmonite necrotizzante, non soltanto in ambito della
Fibrosi Cistica ma in tutti gli ambiti ospedalieri. La produzione di tale tossina viene testata nel
Laboratorio tramite amplificazione del frammento genico che la codifica.
Per quanto riguarda invece i microrganismi che appartengono al gruppo dei batteri Gram-negativi,
vengono ricercati, sia con tecniche fenotipiche che molecolari, specifici meccanismi di resistenza
che rappresentano un problema emergente di salute pubblica. In particolare per le
Enterobacteriaceae vengono eseguiti test molecolari in grado di rilevare i principali geni di
resistenza ai carbapenemi ed i geni responsabili della produzione di ß-lattamasi a spettro esteso
(ESBL).

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h) Attività di ricerca microbiologica

Nel corso degli anni il Laboratorio ha partecipato a numerosi progetti di ricerca finanziati da enti diversi, quali la Fondazione Telethon, il Ministero della Sanità, la Fondazione per la Ricerca Fibrosi Cistica di Verona. Le principali linee di ricerca riguardano l’epidemiologia di batteri patogeni quali Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia complex e Staphylococcus aureus meticillinoresistente, caratterizzandone la virulenza e la resistenza antibiotica. Nei Report Annuali sono riportati i progetti di ricerca e le pubblicazioni relative.

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Testo a cura dello staff del Laboratorio – Centro Regionale Toscano di Riferimento per la Fibrosi Cistica (Dott.ssa Silvia Campana, Dott.ssa Novella Ravenni, Dott.ssa Daniela Dolce, Dott. Gianfranco Mergni). Ultima revisione: agosto 2016